Знаменская церковь была заложена в присутствии цесаревны Елизаветы Петровны 13 мая 1734 года на месте сгоревшей деревянной церкви. До начала XIX века церковь состояла в придворном ведомстве, затем была переведена в приходскую, а с 1846 года вновь стала придворной (до революции 1917 года). До начала Великой Отечественной войны Знаменская церковь оставалась действующей, но в послевоенные годы была переоборудована в хранилище книжного фонда.
В 1991 году церковь возвращена РПЦ. Знаменская церковь является старейшим сооружением Царского Села и первым каменным зданием города Пушкин. Здание выдержано в барочном стиле; является памятником архитектуры федерального значения.