Величественный пятикупольный Успенский собор был заложен по велению царя Иоанна IV Грозного в центре Лавры, на предварительно освобожденном от старых деревянных келий месте. Государь со всем семейством присутствовал при закладке храма.
Его строительство стало продолжением традиции возведения в честь Успения Пресвятой Богородицы главных соборов древних русских городов (в Ростове, Суздале, Владимире, Москве). Освящение храма состоялось в 1585 году уже после смерти царя Иоанна Васильевича, совершил его митрополит Московский и всея Руси Дионисий в присутствии сына Иоанна Грозного государя Федора Иоанновича и его супруги Ирины. Воздвижению Успенского собора было придано государственное значение.